پایان نامه بررسی پتانسیل ریز ازدیادی و باز زایی در تعدادی از ارقام زراعی و گونه های یک ساله یونجه

تعداد صفحات: 78 فرمت فایل: word کد فایل: 10003190
سال: 1390 مقطع: مشخص نشده دسته بندی: پایان نامه مهندسی کشاورزی زراعت
قیمت قدیم:۱۴,۴۰۰ تومان
قیمت: ۱۲,۳۰۰ تومان
دانلود مقاله
  • خلاصه
  • فهرست و منابع
  • خلاصه پایان نامه بررسی پتانسیل ریز ازدیادی و باز زایی در تعدادی از ارقام زراعی و گونه های یک ساله یونجه

    پایان نامه جهت اخذ درجه کارشناسی ارشد رشته اصلاح نباتات

    چکیده

    یونجه از جمله گیاهانی است که به طور مکرر مورد مطالعات کشت بافتی به خصوص در زمینه جنین­زایی قرار گرفته است. باززایی یونجه­های یکساله بسیار سخت‌تر از باززایی ارقام چندساله می‌باشد. پیشرفت­های قابل توجهی با استفاده از مهندسی ژنتیک در جهت بهبود ارزش تغذیه­ای و مقاومت یونجه به تنش­های زیستی و غیرزیستی حاصل شده است و در حال حاضر یونجه به عنوان یک بیوراکتور سبز برای تولید ترکیبات و متابولیت­های با ارزش مورد توجه است. پروتوکل­های مختلف برای باززایی وکشت بافت این گونه‌ها ، اکثرا روش باززایی غیرمستقیم واز طریق جنین زایی بدنی را ارائه نموده‌اند. در پژوهش حاضر باززایی مستقیم گیاه کامل در سه رقم یونجه چندساله و دو گونه یکساله M.rigidula و M.scutellata با استفاده از ریزنمونه گره ساقه مورد بررسی قرار گرفت. بر اساس نتایج حاصل، ترکیب سطوح مختلف تنظیم کننده­های رشد BAP + NAA و TDZ همراه با AgNO3 بر روی صفت میانگین تعداد جوانه­های القاء شده و میانگین تعداد شاخساره­های باززا شده اختلاف معنی­داری (05/0P < ) در ارقام چند ساله و گونه­های یکساله نشان داد و محیط کشت - IV  SIM I حاوی TDZ با غلظت پایین (mg/l 1/0) همراه با  mg/l3 AgNO3 تاثیر معنی­داری از نظر آماری در القاء جوانه و باززایی شاخساره­ها داشت و رقم قره یونجه و گونه M.rigidula میزان باززایی بیشتری نسبت به ارقام دیگرچند ساله وگونه دیگر یکساله نشان دادند. در حضور ترکیب سطوح مختلف هورمون‌های  BAP(mg/l 1) و NAA(mg/l 2/0) و TDZ (mg/l 1/0) جوانه‌های بیشتری القاء شد و حد اکثر جوانه‌های القاء شده در ارقام چند ساله در محیط کشت­های حاوی  BAP(mg/l 1) و NAA(mg/l 2/0) و TDZ (mg/l 1/0) همراه با  mg/l3 AgNO3 و در گونه­های یکساله نیز در محیط کشت­های حاوی BAP(mg/l 1) و NAA(mg/l 2/0) و TDZ (mg/l 1/0) همراه با  mg/l3 AgNO3 مشاهده شد. گیاهچه­ها در حضور محیط کشت MS 2/1حاوی ترکیب NAA (mg/l 5/1) وIBA  (mg/l 1)، ریشه­های حجیم و قوی تولید نمودند. در این تحقیق گونه M. rigidula با اندازه ژنومی دو برابر در مقایسه با گونه M. scutellata پاسخ خوبی نسبت به محیط کشت و باززایی مستقیم نشان داد. دربین ارقام چند ساله نیز، رقم قره یونجه بیشترین پتانسیل باززایی را نشان داد. همچنین بیشترین میزان کالوس در رقم قره یونجه در محیط کشت حاوی  Kin(mg/l 2/0) +2.4-D  (mg/l 1) و casein hydrolysate  (mg/l 500 ) مشاهده گردید ولی باززایی گیاهچه مشاهده نشد. گیاهچه ­های باززا شده از طریق القاء جوانه، به طور نرمال و با زنده مانی 100% به شرایط محیطی غیر استریل سازگار شدند. به نظر می‌رسد پروتکل باززایی مستقیم برای رنج وسیعی از ارقام و گونه­های یونجه قابل کاربرد باشد.

     

    کلمات کلیدی: یونجه چندساله، یونجه یکساله، گره ساقه، باززایی مستقیم، القاء جوانه، کالوس

    مقدمه

    یونجه (Medicago sativa L.) یکی از مهم‌ترین گیاهان علوفه‌ای برای تغذیه دام می‌باشد که با وسعت کشت جهانی بیش از 40 میلیون هکتار، زراعت آن امروزه بسیار توسعه یافته است (زانگ و همکاران 2010). همزیستی یونجه با باکتری‌های ریزوبیوم همزیست و در نتیجه تثبیت نیتروژن، حفظ ساختار مناسب خاک و اثرات بالقوه این گیاه در مدیریت آفات به عنوان مهم‌ترین گیاه تناوبی، اهمیت آن را در کشاورزی پایدار افزایش داده است (قوامی و همکاران، 1377(. یونجه اتوتتراپلوئید (2n = 4X = 32) و دگرگشن بوده و تنوع ژنتیکی زیادی بین ارقام مختلف آن دیده می‌شود. و به دلیل ظرفیت باززایی خوب درون شیشه­ای آن برای یک مدت زمان طولانی از اهداف مطالعات ﮊنتیکی و زیست شناسی سلولی- مولکولی بوده است (اینچوا و همکاران، 2005و شائو و همکاران، 2000). جنس Medicago ترکیبی از گونه­های چند­ساله و یکساله می‌باشد. یونجه­های یکساله در بیش از 250 منطقه جغرافیایی ایران پراکنده هستند که استان آذربایجان غربی یکی از نواحی رویشی آن‌ها است (حیدری شریف آباد و همکاران، 1379). به طور کلی، اگر ژنوتیپ­های یونجه مورد بررسی قرار گیرند، امکان یافتن یک ژنوتیپ با قابلیت باززایی خوب در ژرم پلاسم یونجه وجود دارد (اینچوا و همکاران،2005). افزایش کیفیت و میزان تولید و مقاومت در برابر بیماری‌ها جزء اهداف اصلی برای اصلاح یونجه (.Medicago sativa L) می‌باشد، اما بیشتر دستاوردها در گذشته با استفاده از روش‌های کلاسیک اصلاحی به دست آمده‌اند ، نه از تکنیک‌های مهندسی و این به علت عدم وجود پروتوکل باززایی مؤفق برای طیف وسیعی از ژنوتیپ های یونجه می‌باشد (لی و همکاران،2009). این گیاه دارای سابقه تاریخی طولانی بوده و قدمت آن به ابتدای تاریخ تمدن می‌رسد (قوامی و همکاران، 1377). احتمالا منشا آن ناحیه‌ی کائوکاسوس (Caucasus) یعنی شمال شرقی ترکیه، ارمنستان و شمال غربی ایران می‌باشد (میکاد و همکاران، 1988). سازگاری یونجه به دامنه‌ی وسیعی از شرایط آب و هوایی سبب شده است که این گیاه در بیش از 40 میلیون هکتار از اراضی دنیا کشت شود (زانگ و همکاران، 2010)، که در این میان آمریکا بیشترین سطح زیر کشت را دارا می‌باشد، بطوریکه آمریکا، اروپای شرقی و آرژانتین به تنهایی %70 مناطق سطح زیر کشت یونجه را به خود اختصاص می‌دهند (ورونسی و همکاران، 2010). در ایران نیز که از خاستگاه‌های اولیه یونجه بشمار می‌رود، این گیاه در 600 هزار هکتار از اراضی کشور کشت می‌شود که از این سطح زیر کشت حدود 3/4 میلیون تن علوفه خشک عاید کشاورزان می‌شود (آمارنامه وزارت جهاد کشاورزی، 1388). جنس Medicago به شاخه گیاهان گلدار[1]، زیرشاخه نهاندانگان[2]، رده دولپه‌ای‌ها[3]، راسته روزالس[4] و تیره پاپیلوناسه‌آ[5] متعلق است که شامل گونه‌هایی است که از لحاظ ویژگی‌های مورفولوژیکی بسیار متنوع می‌باشند و حدود دو سوم این گونه‌ها یکساله و بقیه چندساله هستند (لسینز و لسینز، 1979 و ورونسی و همکاران 2010).

     

    تاریخچه و خصوصیات گیاه شناسی یونجه

    1-1-1- اهمیت و گیاهشناسی یونجه

    یونجه زراعی (Medicago Sativa L.) که ملکه گیاهان علوفه‌ای نیز نامیده می‌شود در بخش وسیعی از اروپا و آمریکا به عنوان مهم‌ترین علوفه لگومی شناخته شده است. این گیاه اغلب جهت مصرف به صورت علوفه خشک، علوفه دِهیدراته، حبه‌های علوفه‌ای، علوفه تازه، کود سبز و گهگاهی چراگاه کشت می‌شود (ورونسی و همکاران2010). بقایای یونجه مواد آلی خاک را افزایش می‌دهد و سیستم ریشه‌ای آن مواد غذایی موجود در اعماق خاک را در بین لایه‌های خاک به حرکت در‌آورده و سبب بهبود ساختار خاک، نفوذپذیری نسبت به آب و ظرفیت نگهداری آب می‌شود. کشت یونجه به مقدار کمی به علف‌کش و آفت‌کش نیاز دارد و به دلیل همزیستی باکتری‌های تثبیت کننده نیتروژن (Sinorhizobium meliloti) با ریشه آن به کود نیتروژنه نیازی ندارد، که این ویژگی‌ها با ملاحظات ملی و بین‌المللی فعالیت‌های کشاورزی در ارتباط با محیط زیست سازگار می‌باشد. همچنین مزارع یونجه جهت غنی‌سازی تنوع زیستی بسیار مطلوب می‌باشند (ورونسی و همکاران، 2010). این گیاه دارای پروتئین زیادی بوده و حاوی اکثر اسیدهای آمینه، ویتامین‌ها و هیدرات‌های کربن می‌باشد و میزان فیبرعلوفه آن نیز کم می‌باشد (زانگ و همکاران 2010 و مونتیرو و همکاران، 2003).

     

    1-1-2- ژنتیک و گروه‌های مختلف یونجه

    جنس Medicago دارای اشکال دیپلوئید و تتراپلوئید M. sativa spp. Sativa،M.Sativa spp. Falcata و M. Sativa spp. Glutinosa می‌باشد، که این گونه‌ها به آسانی به اهم تلاقی یافته و دارای کاریوتیپ مشابهی می‌باشند. یکی از موانع عمده در تبادل ژن بین آن‌ها سطح پلوئیدی است که این عامل می‌تواند با تولید گامت‌های کاهش نیافته مرتفع گردد (مک کوی و بینگهام، 1988). اشکال دیپلوئید و گل ارغوانی M. Sativa،  M. Sativa spp. Coerulea نامیده می‌شوند در حالی که اشکال تتراپلوئید و گل ارغوانی M. Sativa، M. Sativa spp. Sativa نامیده می‌شوند که یونجه‌های زراعی چندساله معمولاً در این گروه قرار می‌گیرند. در مقابل فرم‌های بالا، M. Sativa spp. Falcate دارای گل‌های زرد رنگ بوده و اشکال دیپلوئید را شامل می‌شود که دارای 4 گونه چند­ساله تتراپلوئید و دو گونه چندساله هگزاپلوئید می‌باشد (ورنوسی و همکاران، 2010). در حدود 3/1 جنس Medicao را گونه­های یکساله تشکیل می‌دهند که اکثرا دیپلوئید و خودگشن هستند و از بعضی جهات مانند رشد سریع‌تر، کیفیت علوفه ای و مقدار پروتئین خام نسبت گونه­های چند­ساله برتریت نشان می‌دهند (زو و همکاران،1996). یونجه‌­های یکساله (Medic) ممکن است به عنوان یک منبع مفید برای ژن‌های دخیل در صفات زراعی مهم مانند مقاومت به تنش­های زنده و غیر زنده باشند (اینچوا و همکاران، 1999).

     

    1-1-3- انواع یونجه زراعی داخلی

    یونجه همدانی: در برابر سرما مقاوم بوده و ارتفاع آن بیش از سایر ارقام سردسیری و نیمه گرمسیری است. به طوری که ارتفاع ساقه به ۸۰ تا ۹۰ سانتی متر می‌رسد. برگ‌های آن کوچک‌تر و نازک‌تر و باریک‌تر از سایر ارقام است. این رقم در ارتفاعات زیاد به خوبی رشد می‌کند. دانه­های آن کوچک و در حدود یک تا ۱/۲ میلی متر است. یونجه همدانی رنگ بنفش دارد و برای کشت در مناطق سرد و مرتفع مناسب است.

    قره یونجه: مرکز عمل آوری آن آذربایجان است. در برابر سرما مقاوم است و برای کشت به صورت یونجه یکساله و حتی دیم در مناطق سرد به خصوص آذربایجان مناسب است.

     

    1-2- اهمیت کشت بافت

    کشت بافت تکنیکی است که امکان تولید گیاه در محیط درون شیشه­ای را فراهم می‌کند. اساس این تکنیک توتی پوتانسی است که بیان می‌کند هر سلول گیاهی دارای کلیه اطلاعات ژنتیکی لازم برای تبدیل شدن به یک گیاه کامل است. بنابراین کشت سلول، بافت یا اندام این امکان را فراهم می‌کند که با کشت یکی از اجزای فوق سایر قسمت‌های گیاه تشکیل شود. کشت بافت دارای اهداف متعددی است که از جمله مهم‌ترین آنها می‌توان به موارد زیر اشاره کرد

    از مشکلات کشت بافت می‌توان به انواع آلودگی‌های باکتریایی وقارچی اشاره کرد که در برخی از موارد کار را با شکست مواجه می‌سازد. همچنین کشت بافت نیاز به تجربه دارد وگیاهان رشد کرده در محیط درون شیشه­ای به شرایط رطوبت بالا عادت کرده‌اند، بنابراین باید مرحله سازگاری را سپری کرده وسپس به خاک منتقل شوند (حسندخت و همکاران،1385).

    1-3 کشت بافت گیاهی

    ایجاد انگیزه برای بکارگیری تکنیک­های کشت بافت گیاهی در تکثیر و اصلاح گونه­های گیاهی از کار اولیه مورل (1960) روی تکثیر ارکیده در محیط کشت جدید با غلظت بالایی از نمک‌های معدنی توسط موراشیگ و اسکوگ (1962) ناشی شد. از آن به بعد، این تکنولوژی به صورت قابل توجهی رشد یافت وامروزه یک نقش کلیدی در تکثیر ، اصلاح و مهندسی ژنتیک گیاهی ایفا می‌کند.کشت بافت گیاهی بر پایه سه قابلیت گیاهی استوار است: 1 توانمندی[6]که توان یا ظرفیت توارثی یک سلول گیاهی برای نمو به یک گیاه کامل با القای تحریک مناسب است. توانمندی بر این مطلب دلالت می‌کند که هر سلول واجد تمام اطلاعات لازم برای رشد و تکثیر می‌باشد. گر چه از لحاظ نظری همه سلول­های گیاهی توانمند هستند، با این حال سلول‌های مریستمی بیشترین توان بیان این ویژگی را دارند. 2 تمایز زدایی[7]، که توان سلول‌های بالغ برای بازگشت به شرایط مریستمی است و بعد از آن سلول‌ها با بازتمایزی[8] اندام­های جدیدی را سازماندهی می‌کنند. 3 شایستگی[9]، که توانایی ذاتی یک سلول یا بافت گیاهی را برای نمو در یک مسیر مشخص بیان می‌کند. برای مثال، سلول­های با شایستگی رویانی توانایی تبدیل شدن به رویان­های کاملاً فعال را دارند. در مقابل این اصطلاح، واژه ناشایستگی یا ناتوانی ریخت زایی بیان می‌شود.

     

    3-1 انواع کشت درون شیشه‌ای :

    1 کشت گیاهان کامل ( برای مثال، کشت بذر ارکیده ، کشت دانه رست [10]

    2 کشت اندام ( برای مثال، کشت مریستم)، کشت شاخساره[11]: کشت ریشه- کشت برگ- کشت به ساک، کشت رویان

    3 کشت کالوس

    4 کشت سلول

    5 کشت پروتوپلاست

    روش‌های کشت بافت مبتنی بر دو مرحله تمایز زدایی و تمایزیابی می‌باشد. یاخته‌ها، بافت‌ها و اندام‌های گیاهی در طی مرحله تمایز زدایی، توده‌های یاخته‌ای بی‌شکل و متراکمی به نام پینه را تولید می‌نمایند و سپس در شرایط غذایی و محیطی مناسب تمایز یافته و بافت‌های مختلفی را ایجاد نموده و گیاهان کاملی را به وجود می‌آورند. به همین دلیل کشت بافت در مسائل مربوط به رشد و تمایزیابی تحت شرایط باز تولیدی به آزمایش‌های گیاهی کمک گرانبهایی کرده است. کشت بافت در کشاورزی و باغبانی نه تنها به منظور تکثیر گیاهان بلکه اهداف مربوط به جذب مواد غذایی خاک، مقاومت به شوری خاک، حذف عوامل بیماری‌زا، حفظ ذخایر گیاهی ارزشمند در کشت‌ها و در درجه حرارت‌های پایین و اصلاح گیاهان کاربردهای عملی بسیار وسیعی پیدا کرده است. اهمیت کشت بافت گیاهی به اندازه‌ای است که بسیاری از دانشگاه‌های دنیا آن را در دوره‌های آموزشی پیشرفته و مقدماتی خود گنجانیده‌اند و حتی در بعضی از کشورها دوره‌های تخصصی ریزازدیادی را در سطح تولید سازماندهی کرده‌اند (عادلی مسبب، 1378).

    یکی از مهم‌ترین مسائل حل نشده در زیست شناسی عمومی، تنظیم رشد و نمو است. یک روش آزمایشی که در پژوهش‌های تنظیم رشد و نمو گیاه، زیاد بکار برده می‌شود، کشت قسمت­های قطع شده گیاهی و ریز نمونه­های بافتی مشخص روی محیط کشت مصنوعی در آزمایشگاه است. اسکوک و همکارانش کشف کردند که اگر بافت آوندی همراه با ریز نمونه­های مغز روی یک محیط کشت شامل اکسین کشت شود، بافت تحریک شده و متحمل تقسیم سلولی می‌گردد. همچنین کشف کینیتین بدین علت مهم بود که مشخص کرد تقسیم سلولی می‌تواند به واسطه ماده شیمیایی ساده­ای تحریک گردد. بنابراین، با کشف کینتین حدس زده شد که ممکن است مولکول‌های طبیعی با

     

    ساختمان مشابه کینتین فعالیت تقسیم سلولی داخل گیاه را تنظیم کنند. که بعضی از سیتوکینین­های مصنوعی، طبیعی و ترکیباتی مشابه که در کشت بافت استفاده می‌شوند عبارتند از: زآتین، کینیتین (6- فورفوریل آمینو پورین یا N6 – فورفوریل آدنین)، BAP، ZIP، PBA، تیدیازورون. همچنین چندین تنظیم کننده رشد گیاهی که در کشت بافت استفاده می‌شوند شامل: اتیلن، آبسیزیک اسید، سیتوکینین­ها (کینتین)، اکسین­ها (اینولیل 3-استیک اسید) IAA، جیبرلین­ها (جیبرلیک اسید) GA3، زآتین، 2،4- دی کلروفنوکسی استیک اسید (2,4-D)، نفتالن استیک اسید (NAA). اسکوک و میلر (1957) نمونه بی­نظیری از تنظیم هورمونی ریخت­زایی در ریزنمونه­های مغز توتون ارائه کردند. این تحقیق مهم به طور جالب، اثر متقابل ظریف و کمّی بین اکسین و سیتوکینین در کنترل تشکیل جوانه و ریشه از ریز نمونه­های مغز را نشان داد. با ترکیب خاصی از غلظت­های IAA و کینیتین، بافت مغز به صورت کالوس تمایز نیافته­ای رشد کرد و با تغییر نسبتIAA : KIN  آن‌ها موفق به تولید جوانه یا ریشه از ریز نمونه­ها شدند (آزادی و همکاران، 1382).

     

    1-4- تاریخچه کشت بافت یونجه

    باززایی گیاه یونجه (.Medicago sativa L) از طریق جنین­زایی از حدود 30 سال قبل گزارش شد. در آن زمان، یونجه یکی از معدود گیاهان مهمی بود که قابلیت باززایی از کشت بافت را نشان داد. تحقیقات وسیعی در زمینه بهینه­سازی کشت بافت یونجه انجام شده است و اکثرا باززایی غیرمستقیم از طریق جنین­زایی سوماتیکی گزارش شده است (بلوچی و همکاران، 1378 و اینچوا و همکاران،2003 و 2005). باززایی غیرمستقیم بسیار زمانبر و طافت­فرسا بوده و معمولا با تغییرات سوماکلونی وسیع و خصوصیات مورفولوژیکی غیرنرمال همراه است. موفقیت در کشت بافت یونجه­های چند­ساله برای اولین بار توسط Saunders و Bingham در سال 1972 از طریق جنین­زایی سوماتیکی گزارش شد (اینچوا و همکاران، c2005 ). در حال حاضر این گیاه به عنوان یک بیوراکتور سبز برای تولید متابولیت­های ثانویه و پروتئین­های نوترکیب، امکان بهبود کیفیت علوفه و سایر صفات مهم مانند مقاومت به تنش­های زیستی و غیرزیستی در حوزه زیست­فناوری گیاهی از اهمیت ویژه­ای برخوردار است. تهیه یک روش مناسب و کارا برای باززایی کامل، سریع و تولید انبوه گیاه تحت شرایط درون شیشه‌ای از مهم‌ترین اهداف مطالعات کشت بافتی می­باشد که می‌تواند در مطالعات مهندسی ژنتیک و همچنین در برنامه­های اصلاحی مورد استفاده قرار گیرد. با این حال تاکنون یک روشی که برای باززایی در طیف وسیعی از ژنوتیپ­های یونجه مناسب باشد، ارائه نشده است و پاسخ به کشت بافت در این جنس شدیدا وابسته به ژنوتیپ می‌باشد و این وضعیت، کاربرد روش­های بیوتکنولوژیکی در بهبود ژنتیکی آن را محدود می­کند (مولتراسیو و همکاران، 2004 و سمک و همکاران، 2004 وکپسین و همکاران،2006). جنین­زایی سوماتیکی یکی از روش­های مهم در کشت بافت به شمار می‌آید که در اکثر گونه­های گیاهی مورد استفاده قرار می‌گیرد اما به دلیل مشکلات متعددی مانند سرعت رشد، تبدیل آهسته و باززایی دوره­ای جنین­زایی سوماتیکی به گیاهچه­های نرمال کاربرد رایج آنرا محدود می‌کنند (ایچنوا و همکاران،2005). اگرچه در بسیاری از گیاهان، بافت تمایز نیافته به سختی بعد از کشت تبدیل به گیاه می‌شود، اما در یونجه امکان باززایی از کالوس تشکیل شده از بافت‌های متعدد حتی پروتوپلاست و سلول‌های گیاهی فاقد دیواره سلولی وجود دارد. اگرچه گونه­های یونجه چند­ساله ممکن است از طریق روش‌های درون شیشه­ای غیرمستقیم و یا مستقیم باززا شوند، اما این گونه­ها به دلیل درجه بالای هتروزیگوسیتی و اندازه بزرگ ژنوم، نمی‌توانند به عنوان مدل برای لگومها به کار روند. یونجه­های یکساله نسبت نزدیکی با یونجه زراعی دارند اما آن‌ها دیپلوئید و خودگشن بوده و دارای سیکل زندگی کوتاه و محدود هستند؛ بنابراین از نظر تحقیقات مولکولی و ژنتیکی خیلی مناسب‌تر از گونه­های چند­ساله و دگر بارور زراعی M. sativa هستند. همچنین گونه­های وحشی ممکن است به عنوان یک مخزن مفید برای ژن‌های دخیل در صفات زراعی مثل مقاومت به تنش­های زنده و غیرزنده باشند (ایچنوا و همکاران،1999)

     

    Abstract

     

    Alfalfa is one of the most frequently studied species from the production of tissue culture derived embryos point of view.The regeneration of annual medics is more difficult than those perennials. Most of the protocols for regeneration and tissue calture from this spices have been reported from indirect regeneration method via somatic embryogenesis. Importance developments have been achieved bye genetic engineering for improve of nutrient value and resistance to biotic and abiotic stresses and nowadays alfalfa is noticed as green bioreactor for produce valueable combinations and metabulites. In present study were studied direct plant regeneration completed in three varieties of perennial alfalfa and annual medics M.rigidula and M.scutellata using stem nodal explants. Based on the results, combination of different levels of BAP + NAA and TDZ hormones with 3mg/l AgNO3 were shown statistically significant (P < 0.05) between varieties of perennial and annual species for the mean number of induced shoot-bud and shoot regeneration and SIMI-IV medium containing low concentrations of TDZ (0.1mg/l) with 3mg/l AgNO3 had a statistically significant effect in bud induction and shoot regeneration and Kara yonje cultivar and M.rigidula showed regeneration rate than any other varieties of perennial and annual specie. In the presence of different levels of BAP (1mg/l) and NAA (0.2mg/l) and TDZ (0.1mg/l) were induced more shoots and buds induced and the maximum number of induced shoot-bud were observed in varieties of perennial and in the medium containing BAP (1mg/l) and NAA (0.2mg/l) and TDZ (0.1mg/l) with 3mg/l AgNO3 and annual species in the medium containing BAP (1mg/l) and NAA (0.2mg/l) and TDZ (0.1mg/l) with 3mg/l AgNO3. Plantlets were incubated in the presence of 1/2MS composition containing NAA (1.5mg/l) and IBA (1mg/l), were produced bulky and strong roots. In this study, M. rigidula with the doubled genome size showed well respond to the culture medium and direct regeneration compared with M. scutellata. Among the varieties of perennial, Kara yonje cultivar showed the highest potential for regeneration. Also the highest amount of callus was shown in Kara yonje cultivar on medium containing Kin (0.2mg/l) + 2.4-D (1mg/l) and casein hydrolysate (500mg/l), but shoot regeneration was not observed. Seedlings from induced shoot-buds were consistent normally with 100% survival at non-sterile conditions. Direct regeneration protocol appears to be applicable to a wide range of alfalfa varieties and species.

     

    Key words: perennial alfalfa, medics, stem nodes, direct regeneration, bud induction, callus

  • فهرست و منابع پایان نامه بررسی پتانسیل ریز ازدیادی و باز زایی در تعدادی از ارقام زراعی و گونه های یک ساله یونجه

    فهرست:

    فصل اول: کلیات

    مقدمه .......................................................................................................................................................................................................................................... 2

    1-1- تاریخچه و خصوصیات گیاه شناسی یونجه................................................................................................................................................................3

    1-1-1- اهمیت و گیاهشناسی یونجه....................................................................................................................................................................................3

    1-1-2- ژنتیک و گروه‌های مختلف یونجه...........................................................................................................................................................................3

    1-1-3- انواع یونجه زراعی داخلی .......................................................................................................................................................................................4

    1-2- اهمیت کشت بافت..........................................................................................................................................................................................................4

    1-3- کشت بافت گیاهی .........................................................................................................................................................................................................5

    1- 4- تاریخچه کشت بافت یونجه..........................................................................................................................................................................................7

     

    فصل دوم: بررسی ادبیات موضوع و سابقه تحقیق

    2-1- باززایی درون شیشه­ای................................................................................................................................................................................................ 10

    2-1-1- باززایی مستقیم در یونجه.......................................................................................................................................................................................10

    2-1-2- باززایی غیرمستقیم در یونجه................................................................................................................................................................................13

     

    فصل سوم: روش تحقیق

    3-1- رقم مورداستفاده...........................................................................................................................................................................................................24

    3-2- محیط کشت، ترکیبات و آماده سازی آن................................................................................................................................................................24

    3-2-1- محلول­های ذخیره مواد معدنی برای تهیه محیط کشتSH  .......................................................................................................................34

    3-2-2- محلول های ذخیره مواد تنظیم کننده رشد....................................................................................................................................................25

    3-3- شرایط کشت، ضد عفونی بذر و کشت ریزنمونه­ها..................................................................................................................................................26

    3-3-1- باززایی مستقیم  از گره ساقه.................................................................................................................................................................................26

    3-3-2- سازگاری گیاهچه­ها..................................................................................................................................................................................................28

    3-4- باززایی غیرمستقیم ..................................................................................................................................................................................................... 28

    3- 5- روش و ابزار گردآوری اطلاعات..................................................................................................................................................................................30

    3-6- روش آماری و تجزیه داده­ها.........................................................................................................................................................................................30

     

    فصل چهارم: تجزیه و تحلیل اطلاعات

    4-1- القاء جوانه و باززایی .....................................................................................................................................................................................................32

    4-1-1- القاء جوانه در محیط کشت  SIM I......................................................................................................................................................................32

    4-1-2- باززایی شاخساره در محیط کشت SIM I...........................................................................................................................................................35

    4-1-3- القاء جوانه در محیط کشت  SIM II....................................................................................................................................................................37

    4-1-4- باززایی شاخساره در محیط کشتSIM II  ........................................................................................................................................................40

    4-1-5- اثر ژنوتیپ­های مختلف یونجه چند­ساله و یکساله در القاء جوانه و باززایی شاخساره در محیط کشت SIM I....................................43

    4-1-5-1- اثر ژنوتیپ­های مختلف یونجه­های چند­ساله در القاء جوانه در محیط کشت  SIM I...........................................................................43

    4-1-5-2- اثر ژنوتیپ­های مختلف یونجه­های یکساله در القاء جوانه در محیط کشت  SIM I..............................................................................43

    4-1-5-3- اثر ژنوتیپ­های مختلف یونجه­ چند­ساله در باززایی شاخساره در محیط کشت  SIM I.......................................................................44

    4-1-5-4- اثر ژنوتیپ­های مختلف یونجه­ یکساله در باززایی شاخساره در محیط کشت  SIM I..........................................................................45

    4-1-6- اثر ژنوتیپ­های مختلف یونجه چند­ساله و یکساله در القاء جوانه و باززایی شاخساره در محیط کشتSIM II....................................45

    4-1-6-1- اثر ژنوتیپ­های مختلف یونجه چندساله در القاء جوانه در محیط کشت SIM II..................................................................................45

    4-1-6-2- اثر ژنوتیپ­های مختلف یونجه­ یکساله در القاء جوانه در محیط کشت  SIM II.....................................................................................46

    4-1-6-3- اثر ژنوتیپ­های مختلف یونجه چند­ساله در باززایی شاخساره در محیط کشت  SIM II.....................................................................47

    4-1-6-4- اثر ژنوتیپ­های مختلف یونجه یکساله در باززایی شاخساره در محیط کشت  SIM II.........................................................................47

    4-2- ریشه­زایی........................................................................................................................................................................................................................48

    4-2-1- ایجاد ریشه در یونجه­های چند­ساله......................................................................................................................................................................48

    4-2-2- درصد ایجاد ریشه در یونجه­های چند­ساله..........................................................................................................................................................48

    4-2-3- درصد ایجاد ریشه در یونجه­های یکساله..............................................................................................................................................................50

    4-3- سازگاری و انتقال به شرایط گلخانه...........................................................................................................................................................................50

    4-4- القاء کالوس در یونجه­های چند­ساله و یکساله.........................................................................................................................................................51

    4-4-1- باززایی غیرمستقیم از کالوس یونجه.....................................................................................................................................................................52

     

    فصل پنجم: نتیجه گیری و پیشنهادات

    5-1- یونجه­های چند­ساله.......................................................................................................................................................................................................55

    5-1-1- باززایی مستقیم ........................................................................................................................................................................................................55

    5-1-1-1- القاء جوانه و باززایی شاخساره تحت تاثیر سطوح مختلف BAP و NAA ..............................................................................................55

    5-1-1-2- القاء جوانه و باززایی شاخساره تحت تاثیر TDZ همراه با AgNO3 .........................................................................................................56

    5-2- یونجه­های یکساله..........................................................................................................................................................................................................56

    5-2-1- باززایی مستقیم ........................................................................................................................................................................................................56

    5-2-1-1- القاء جوانه و باززایی شاخساره تحت تاثیر سطوح مختلف BAP و NAA ..............................................................................................56

    5-2-1-2- القاء جوانه و باززایی شاخساره تحت تاثیر TDZ همراه با AgNO3...........................................................................................................57

    5-3- باززایی غیر مستقیم در یونجه­های چند­ساله و یکساله..........................................................................................................................................59

    5-4- نتیجه گیری و پیشنهادات...........................................................................................................................................................................................60

    فهرست منابع و ماخذ.............................................................................................................................................................................................................61

    چکیده انگلیسی.......................................................................................................................................................................................................................

    منبع:

    آزادی، پ؛ باقری، ه :(1382)،اصلاح گیاهان با استفاده از کشت درون شیشه‌ای. ( ت‍‍‍‍‍‍ألیف تاجی ، اکرم ، پی . پرکاش ، کومار ،لاکشمان .پرکاش).انتشارات دانشگاه بوعلی سینا.چاپ اول.188 ص

    آمارنامه . وزارت جهاد کشاورزی. :(1388)،جلد دوم.

    بلوچی، ح. ر؛ مدرس ثانوی، س.ع.م.؛ علیزاده، ب: (1387). عوامل مؤثر بر دوره رکود و جوانه زنی دو گونه یونجه یکساله، مجله زیست شناسی ایران ، جلد 21 ، شماره2.ص270-261.

    حیدری شریف آباد،ح ؛ ترک نژاد، ا: ( 1379). یونجه‌های یکساله. انتشارات مؤسسه تحقیقات جنگل‌ها و مراتع. چاپ اول. ص 167 .

    رفیعی، گ؛ امیدی، م؛ ولی زاده، م؛ باغبان، ب؛ خسروشاهی، م:  1384،" کشت سوسپانسیون و بررسی جنین­زایی در چند رقم یونجه ایرانی " (Medicago sativa)،چهارمین همایش ملی بیوتکنولوژی جمهوری اسلامی ایران، کرمان

    عادلی مسبب، ف: 1378،" نقش کشت بافت در توسعه کشاورزی ".رویان : مجله نوین کشاورزی

    عسکری، ح؛ صفرنژاد، ع؛ کاظمی تبار، س.ک؛ حمیدی، ح: 1382، "بررسی افزایش تحمل یونجه(Medicago sativa L.)  در برابر خشکی با استفاده از تنوع سوماکلونال"، فصلنامه پژوهشی تحقیقات ژنتیک و اصلاح گیاهان مرتعی و جنگلی ایران جلد 12 شماره 2، ص130-117

    قوامی، ف؛ رضایی، ع؛ ارزانی، ا؛ عبدمیشانی، س: 1377،" بررسی تنوع الگوهای الکتروفورتیک  پروتئین­های ذخیره­ای دانه در ماش". چکیده مقالات پنجمین کنگره زراعت و اصلاح نباتات ایران. کرج.

    مجله اینترنتی کشاورزی و منابع طبیعی شمیز

    Akasaka-Kennedy Y, Yoshida H, Takahata Y (2005). Efficient plant regeneration from leaves of rapeseed (Brassica napus L.): the influence of AgNO3 and genotype, Plant Cell Rep 24, 649–654

    Alam MJ, Alam I, Sharmin SA, Rahman MM, Anisuzzaman M, Alam MF (2010). Micropropagation and antimicrobial activity of Operculina turpethum (syn. Ipomoea turpethum), an endangered medicinal plant, POJ 3(2):40-46

    Al-Khayri JM, Al-Bahrany AM (2004). Genotypedependent in vitro response of date palm (Phoenix dactylifera L.) cultivars to silver nitrate, Sci Hortic-Amsterdam 99 (2): 153–162

    Amin,  M.N., Shahrear, A., Sultana, S., Alam, M.R. and Azad, M.A.K.( 2002). In vitro rapid clonal propagation of an ornamental plant – Ixora fulgens Roxb, Online Journal of Biological Sciences 2 (7): 485 – 488

    Anantasaran J, Kanchanapoom K (2008). Influence of medium formula and silver nitrate on in vitro plant regeneration of zinnia cultivars, Songklanakarin J Sci Technol 30 (1): 1–6

    Babaoglu,  M. & Yorgancilar, M. (2000). TDZ-specific plant regeneration in salad burnet, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 440: 31–34

    Barakat, M. N.,  Milad, S., and Khadr, F. H. (1993). Screening Alfalfa for Regeneration Capacity, J. King Saud Univ. Vol.5.Agric. Sci. (2),pp237-249.

    Barna, K.S. and A.K. Wakhlu. (1995). Effect of thidiazuron on micropropagation of rose, In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant 31: 44-45

    Benniaamin, A.,Manickam, V.S., Jhonsan, M. and Joseph, L.H. (2004). Micropropagation of Crateaeva magna (Lour) DC-A medicinal plant, IndianJournal of Biotechnology 3: 136 – 138.

    Beyer EM (1976). A potent inhibitor of ethylene action in plants, Plant Physiol 58 (3): 268–271

    Bonnin, I., Prosperi, J.M., and Olivieri, I., (1997).  Comparison of Quantitative Genetic Parameters Between Two Natural Population of Selfing Plant Species Medicago truncatula Gaertn, Theor. Appl. Genet., vol. 97, no. 5, pp. 641–651

    Chen CC, Chen SJ, Sagare AP, Tsay HS (2001). Adventitious shoot regeneration from stem internode explants of Adenophora triphylla (Thunb.) A. DC. (Campanulaceae) -An important medicinal herb, Bot Bull Acad Sin 42: 1–7

    Chi GL, Barfield DG, Sim GE, Pua EC (1990). Effect of silver nitrate and aminoethoxyvinylglycine on in vitro shoot and root organogenesis from seedling explants of recalcitrant Brassica genotypes, Plant Cell Rep 9: 195– 198

    Chin-Yi LU (1993). The use of thidiazuron in tissue culture, In Vitro Cell. Dev. Biol 29P: 92–96

    Cline MG (1996). Exogenous auxin effects on lateral bud outgrowth in decapitated shoots, Ann Bot 78:255–266

    Cogbill S, Faulcon T, Jones G, McDaniel M, Harmon G, Blackmon R, Young M (2010). Adventitious shoot regeneration from cotyledonary explants of rapid-cycling fast plants of Brassica rapa L., Plant Cell Tiss Organ Cult 101:127–133

    Dai Y, Wang H, Li B, Huang J, Liu X, Zhou Y, Mou Z, Li J (2006). Increased expression of mapkinase kinase causes deficiency in polar auxin transport and leads to plant architectural abnormality in Arabidopsis, Plant Cell 18:308–320

    Duque,  A.S., Pires, A.S., Santos, D.M.D., Fevereiro, P (2006). Efficient somatic embryogenesis and plant regeneration from long-term cell suspenpion cultures of Medicago Truncatlula cv. Jemalong, In Vitro Cell. Dev. Biol.—Plant 42:270–273

    Faure O, Diemer F, Moja S & Jullien F (1998). Mannitol and thidiazuron improve in vitro shoot regeneration from spearmint and peppermint leaf disks, Plant Cell Tiss. Org. Cult. 52: 209–212

    Gamborg OL, Miller RA, Ojima K (1968). Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells, Exp Cell Res 50:151–158

    Hidson, S., Mcelroy, A.R., Portelance, C (1998). Media and genotype effects on the development and conversion of somatic Alfafa (Medicago sativa L.) embtyos,In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant 34:181-184

    Hosokawa K, Nakano M, Oikawa Y & Yamamura S (1998). Adventitious shoot regeneration from leaf, stem and root explants of commercial cultivars of Gentiana, Plant Cell Rep. 15(8): 578–581

    Hosseini-Nasr M, Rashid A (2003). Thiadiazuron-induced high frequency shoot regeneration from root region of Robinia pseudoacacia L. seedlings, Biol PLANTARUM 47: 591–596

    Hussain Shah, S., Wainwright, S.J. and Merrett, M. J. (2003). Regeneration and Somaclonal Variation in Medicago sativa and Medicago media, Pakistan Journal of Biological Sciences 6(9):816-820 .

    Hutchinson MJ, Saxena PK (1996). Acetylsalicylic acid enhances and synchronizes thidiazuron-induced somatic embryogenesis in geranium (Pelargonium × hortorum Bailey) tissue culture, Plant Cell Rep 15: 512–515

    Iantcheva A, Brown S, Atanassov A (2003). Flow cytometric analysis in diploid medicago species from algeria: Relationship between genome size and competence for direct somatic embryo formation, Biotechnol. & Biotechnol., 17(2): 44-49

    Iantcheva A, Vlahova M, Atanassov A (2005a). Investigation of the potential of two wild medicago species–medicago orbicularis and medicago arabica for in vitro callusogenesis and direct organogenesis, Biotechnol. & Biotechnol. Eq 19(3): 27–31

    Iantcheva A, Vlahova M, Bakalova E, Kondorosi E, Elliott MC, Atanassov A (1999). Regeneration of diploid annual medics via direct somatic emberyogenesis promoted by thidiazuron and benzylaminopurine, Plant Cell Rep 18:904–910

    Iantcheva,  A., Slavov,  S., Prinsen, E., Vlahova, M., Onckelen,  H.V., Atanassov, A. (2005b). Embryo induction and regeneration from root explants of Medicago truncatula after osmotic pre-treatment, Plant Cell Tiss Organ Cult 81:37–43

    Iantcheva, A., Vlahova, M., Atanassov, A. (2005c). Somatic Embryogenesis in Genera Medicago: an Overview, Plant Cell Monogr (2):285-304

    Ibragimova, S.S. and Smolenskaya, S.E., (1997). Plant Regeneration from Seedling Apex in Annual Medics, Acta Agron. Hung, vol. 45, no. 2, pp. 109–117.                       

    Kanyad, M., Dessai, A.P., Prakash, C.S. (1994). Thidiazuron promotes high frequency regeneration of peanut (Arachis hypogaea) plants in vitro, Plant Cell Rep. 14: 1-5

    Kao, K. N., Michanayluk, M.R. (1981). Embryoid formation in alfalfabcell suspension cultures from different plants, In Vitro Vol. 17, No. 7, 645-648

    Kepczyn. E., Sylwia. S., Zielin.´s. (2006). Regulation of Medicago sativa L. somatic embryos regeneration by gibberellin A3 and abscisic acid in relation to starch content and a-amylase ativity, Plant Growth Regul, 49:209–217

    Khawar KM, Sancak C, Uranbey S, Zca S (2004). Effect of thidiazuron on shoot regeneration from different explants of lentil (lens culinaris medik.) via organogenesis, Turk J Bot 28: 421–426

    Kim MK, Sommer HE, Bongarten BC, Merkle SA (1997). High frequency induction of adventitious shoots from hypocotyl segments of Liquidambar styraciflua L. by thidiazuron, Plant Cell Rep 16: 536–540

    Kulkarni, A.A., Thengane, S.R. and Krishnamurthy, K.V. (2000). Direct shoot regeneration from node, internode, hypocotyls and embryo explants of Withania Somnifera, Plant cell, tissue and organ culture 62(3): 203 - 209.

    Li JJ, Wu YM, Wang T, Liu JX (2009). In vitro direct organogenesis and regeneration of Medicago sativa, Biol PLANTARUM 53 (2): 325–328

    Luo CY (1993). The use of thidiazuron in tissue culture, In Vitro Cell Dev Biol-Pl 29: 92–96

    Malik AK& Saxena PK (1992).Thidiazuron induces high-frequency shoot regeneration in intact seedlings of pea (Pisum sativum), chickpea (Cicer arietinum) and lentil (Lens culinaris), Aust. J. Plant Physiol. 19: 731–40

    Malik, K.A. Saxena, P.K. (1992). Regeneration in Phaseolus vulgaris L.: High frequency induction of direct shoot formation in intact seedlings by N6-benzylaminopurine and thidiazuron, Planta 186: 384-389

    Mallikarjuna K, Rajendrudu, G (2007). High frequency in vitro propagation of Holarrhena antidysenterica from nodal buds of mature tree, Biol Plant 51: 525–529

    Mehra, P.N and Cheema, G.S. (1980). Clonal multiplication in vitro of Himalayan Poplar (Populus ciliata), Phytomorphology 30: 336 – 343.

    Michaud, R., W.F. Lehman and M.D. Runbaugh. (1988). World distribution and historical development. In Alfalfa and alfalfa improvement. Agronomy Monograph 29, (ed. AA Hanson, DK Barnes and RR Hill), pp. 25–92. Madison, USA.

    Mohamed SV, Sung JM, Jeng TL, Wang CS (2006). Organogenesis of Phaseolus angularis L.: high efficiency of adventitious shoot regeneration from etiolated seedlings in the presence of N6-benzylaminopurine and thidiazuron, Plant Cell Tiss Org 86 (2): 187–199

    Mohiuddin AKM, Chowdhury MKU, Zaliha CA, Suhaimi N (1997). Influence of silver nitrate (ethylene inhibitor) on cucumber in vitro shoot regeneration, Plant Cell Tiss Org 51: 75–78

    Moltrasio, R., Robredo, C. G. , Gomez, M. C., DiazPaleo, A. H., Diaz, D.G., Rios, R.D.,Franzone, P. M. (2004). Alfalfa (Medicago sativa)somatic embryogenesis :genetic controland introduction of favourable alleles into elite Argentinean germplasm, PlantCell,Tissue and Organ Culture 77: 119–124.

    Monteiro M, Appezzato-da-Gloria B, Valarini MJ, Oliveira CAd, Vieira MLC (2003). Plant regeneration from protoplasts of alfalfa (Medicago sativa L.) via somatic embryogenesis, Scientia Agricola, 60 (4): 683-689.

    Murashige T, Skoog F (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures, Physiol Plant 15:473–476

    Naik SK, Pattnaik S, Chand PK (2000). In vitro propagation of pomegranate (Punica granatum L. cv. Ganesh) through axillary shoots proliferation from nodal segments of mature tree, Scientia Hort 79: 175–183

    Neves, L.O., Tomaz, L., Feveriro, M.P.S. (2001). Micropropagation of Medicago truncatula Gaertn. cv. Jemalong and Medicago truncatula ssp. Narbonensis, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 67: 81–84

    Ninković, S., Miljuš-Djukić, J., Nešković, M. (1995). Genetic transformation of alfalfa somatic embryos and their clonal propagation through repetitive somatic embryogenesis, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 42:225-260

    Noaman, M.M., Ahmad, E. (2004). Development of Alfafa tolerant to salinity stress using organogenesis technique, Biotechnology,3(2):136-139

    Nolan KE, Rose RJ, Gorst JR (1989). Regeneration of Medicago truncatula from tissue culture increased somatic embryogenesis using explants from regenerated plants, Plant Cell Rep 8:278–281

    Okumura,  K., Oosawa, K., Nakashima, K. (1991).  A new culture system with agar-liqid sequential media for the development of somatic embryos in alfalfa(medicago sativa L.), Bull. Natl. Grassel. Res. Inst. No.45:53-59

    Ozden-Tokatli, Y., Ozudogru, E.A., Akcin, A. (2005). In vitro response of pistachio nodal explants to silver nitrate, Sci. Hort., 106: 415-426.

    Patnaik J, Debata BK (1996). Micropropagation of Hemidesmus indicus (L.) R. Br. through axillary bud culture, Plant Cell Rep 15: 427–430

    Punyarani K, Sharma GJ (2010). Micropropagation of Costus speciosus (Koen.) using nodal segment culture, Not Sci Biol 2 (1): 58–62

    Reisch, B., and Bingham, E.T., (1980). The genetic control of formation from callus cultures of diploid alfalfa, Plant Sci. Leu. 20:71-77

    Safdari Y, Kazemitabar SK (2010). Direct shoot regeneration, callus induction and plant regeneration from callus tissue in Mose Rose (Portulaca grandiflora L.), POJ 3(2):47-51

    Sahoo Y, Chand PK (1998) In vitro multiplication of medical herb Tridax procumbens L. (Mexican daisy, coat button) influence of explanting season, growth regulator, synergy, culture passage and passing substrate, Phytomorphology 48: 195–205

    Sajid ZA, Aftab F (2009). Effect of thidiazuron (TDZ) on in vitro micropropagation of solanum tuberosum l. cvs. desiree and cardinal, Pak J Bot 41(4): 1811–1815

    Samac, D.A. and Temple, S.J. (2004). Development and utilization of transformation in Medicago Species. In Lianh, G.H. and Skinner, D.Z. (eds). Genetically Modified Crops: Their Development, Uses and Risks, Food Products Press, New York, pp. 165-195.

    Scarpa, G.M., Pupilli, F., Damiani, F., and Arcioni, S., (1993). Plant Regeneration from Callus and Protoplast in Medicago polymorpha, Plant Cell Tiss. Org. Cult., vol. 35, pp. 49–57.

    Shao, C.Y., ussinova, E.R., Iantcheva, A., Atanassov, A., McCormac, A. , Chen, D.F. , Elliott, M.C. , Slater. A., (2000). Rapid transformation and regeneration of alfalfa (Medicago falcata L.)via direct somatic embryogenesis, PlantGrowthRegulation 31: 155–166.

    Sharon, Madhuri and D’Souza, M.C. (2000). In vitro clonal propagation of annatto (Bixa orellana L.), Curr. Sci. 78: 1532 - 1534.

    Sivanesan I, Jeong BR (2007). Direct shoot regeneration from nodal explants of Sida cordifolia Linn, In Vitro Cell Dev- Pl 43:436–441

    Smolenskaya, S.A., Ibragimova, S.S. (2002). Restorative Morphogenesis in vitro in the Annual Medics in the Presence of Benzylaminopurine, Russian Journal of Developmental Biology 33 (6): 349–354

    Sunil B, Abdullah JO, Sreeramanan S, Karuthan C (2009). Shoots Induction from Hibiscus Rosa-sinensis Nodal Explant Using N6-benzylaminopurine (BAP), Res J Agr Biol Sci 5(4): 403–410

    Svetoslavova, G., Vlahova, M., Iantcheva, A., Atanassov, A. (2005). High frequency plant regeneration of diploid Medicago Coerulea through somatic embryogenesis, Biotechnol. & Biotechnol. Eq.57-61

    Takamizo, T., Suginobu, K.I., Ohsugi, R.(1991). Somatic embryogenesis in a recalcitrant cultivar of alfalfa (Medicago sativa L.) in an improved medium, Bull. Natl. Grassl. Res. Inst. 44:15-22

    Thiruvengadam M, Rekha KT, Yang CH, Jayabalan N, Chung IM (2010). High-frequency shoot regeneration from leaf explants through organogenesis in bitter melon (Momordica charantia L.), Plant Biotechnol Rep 4: 321– 328

    Thomas, T.D. (2003). Thidiazuron induced multiple shoot induction and plant regeneration from cotyledonay explants of mulberry, Biol. Plant. 46: 529-533.

    Tian, L., Brown, D.C.W., Watson, E (2002). Continuous long-term somatic embryogenesis in alfalfa, In Vitro Cell. Dev. Biol.—Plant 38:279–284

    Uddin, M.S., Nasirujjaman, K., Zaman, S. and Reza, M.A. (2005). Regeneration of multiple shoots from different explants viz. Shoot tip, Nodal segment and Cotyledonary node of in vitro grown seedlings of Peltophorum pterocarpum (DC.) Backer ex K. Heyne. Biotechnology 4 (1): 35 - 38

    Uliaie ED, Farsi M, Ghreyazie B, Imani J (2008) Effects of genotype and AgNO3  on shoot regeneration in winter cultivars of rapeseed (Brassica napus), Pak J Biol Sci 11(16): 2040–2043

    Uranbey S (2005). Thidiazuron induced adventitious shoot regeneration in henbane (Hyoscyamus niger L.), Biol Plant 49 (3): 427–430

    Vance, C.P., Johnson, L.E.B., Boylan, K.L.M. (1984). Tissue Cultures Derived from Ineffective Root Nodules of Alfalfa, Callus initiation and enzymic comparisions, Plant Physiol. 76: 984-988

    Veronesi, F., C. Brummer and C. Huyghe. (2010). Alfalfa, Springer Sci. 395-436.

    Walton, P.D., Brown, D.C.W. (1988).  Screening of Medicago wild speceies for callus formation and the genetics of somatic embryogenesis, J. Genet. Vol. 67, No.2, pp.95-100

    Xiaochun, M., Yuexue, Zh., Hailing, Zh., Chen, Sh., Jikai, L., Xiangling, X., (2010). Alfalfa Establishment of in vitro Regeneration System of Zhaodong Alfalfa and Pleven6, Chinese Agricultural Science Bulletin, 26(13):47-52

    Zare N, Valizadeh M, Tohidfar M, Mohammadi SA, Malboobi MA, Habashi AA (2009).  Selection of regenerative genotypes from Iranian alfalfa cultivars, J Food Agric Environ 7 (3&4): 567–572

    Zhang P, Phansiri S, Puonti-Kaerlas J (2001). Improvement of cassava shoots organogenesis by the use of silver nitrate  in vitro, Plant Cell Tiss Org 67: 45–54

    Zhang, H., H. Qi-man and S. Jin ( 2010). Development of Alfalfa (Medicago sativa L.) Regeneration System and Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Agricultural Sciences in China. 9: 170-178.

    Zhu, YP, Sheaffer CC, Barnes, DK, Zhu YP (1996). Forage yield and quality of six annual Medigaco species in the north central USA, Agron J 88: 955–960

    .

ثبت سفارش
عنوان محصول
قیمت